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新型量子點標記核酸探針制備與原位雜交

更新時間:2024-11-19      點擊次數:333

一、引言


在現代生物醫(yī)學研究中,核酸檢測技術是理解基因功能、診斷疾病以及研究病原體的核心手段之一。原位雜交(ISH)作為一種重要的核酸檢測方法,能夠在細胞或組織水平上對特定的核酸序列進行定位和定量分析。傳統(tǒng)的原位雜交技術往往依賴于放射性或熒光標記的核酸探針,但這些方法存在一些局限性,如放射性物質的危害、熒光標記的光穩(wěn)定性差和靈敏度不足等問題。


量子點(QDs)作為一種新型的納米材料,具有更好的光學性質,如寬激發(fā)光譜、窄發(fā)射光譜、高量子產率和良好的光穩(wěn)定性。這些特性使得量子點在生物標記領域具有巨大的應用潛力。將量子點應用于核酸探針標記并用于原位雜交,有望克服傳統(tǒng)標記方法的不足,提高檢測的靈敏度和準確性。近年來,雖然在量子點標記核酸探針方面已經取得了一些進展,但仍存在許多挑戰(zhàn),例如量子點與核酸的高效偶聯(lián)、標記后探針的穩(wěn)定性以及雜交條件的優(yōu)化等。因此,本研究旨在開發(fā)一種新型的量子點標記核酸探針制備方法,并優(yōu)化其在原位雜交中的應用,以滿足生物醫(yī)學研究日益增長的需求。

二、量子點的選擇與性質

(一)量子點的類型


目前,常見的量子點包括 CdSe、CdS、ZnSe、InP 等。其中,CdSe 量子點由于其優(yōu)異的光學性能,如在可見光范圍內具有可調節(jié)的發(fā)射波長和較高的量子產率,是本研究的主要選擇對象。然而,考慮到 Cd 元素的生物毒性,在實際應用中需要對其進行適當的表面修飾以降低毒性。

(二)量子點的光學性質


量子點的光學性質與其尺寸密切相關。通過改變量子點的粒徑,可以實現從紫外到紅外的連續(xù)可調的發(fā)射光譜。這種特性使得可以選擇不同發(fā)射波長的量子點同時標記多種核酸探針,實現多靶點的同時檢測。此外,量子點的寬激發(fā)光譜允許使用單一激發(fā)光源激發(fā)多種不同發(fā)射波長的量子點,大大簡化了檢測系統(tǒng)。

三、核酸探針的設計與選擇

(一)核酸探針類型


根據檢測目標的不同,可以選擇不同類型的核酸探針,如 DNA 探針、RNA 探針和寡核苷酸探針等。對于基因表達分析,通常選擇與目標 mRNA 互補的 RNA 探針或寡核苷酸探針。在病原體檢測中,針對病原體特異性基因序列設計的 DNA 探針是常用的選擇。本研究中,我們根據具體的實驗目的設計了一系列特異性的寡核苷酸探針。

(二)探針長度與特異性


探針的長度對其特異性和雜交效率有重要影響。一般來說,較長的探針具有更高的特異性,但雜交速度較慢;較短的探針雜交速度快,但特異性可能降低。因此,需要根據目標序列的復雜性和檢測要求,優(yōu)化探針的長度。在我們的實驗中,通過生物信息學分析和實驗驗證,確定了長度在 20 - 30 個堿基的寡核苷酸探針,在保證特異性的同時具有較好的雜交效率。

四、量子點標記核酸探針的制備方法

(一)量子點的表面修飾


為了實現量子點與核酸的有效偶聯(lián),首先需要對量子點進行表面修飾。常用的表面修飾方法包括使用巰基化合物、聚乙二醇(PEG)等。我們采用了巰基 - PEG 共聚物對 CdSe 量子點進行表面修飾。這種修飾不僅可以提高量子點的水溶性和生物相容性,還可以提供活性基團用于后續(xù)的偶聯(lián)反應。具體步驟如下:


  1. 將 CdSe 量子點分散在有機溶劑中,如氯仿。

  2. 加入適量的巰基 - PEG 共聚物,在超聲條件下反應數小時。

  3. 通過透析或超濾等方法去除未反應的巰基 - PEG 共聚物和有機溶劑,得到水溶性的表面修飾量子點。

(二)量子點與核酸的偶聯(lián)


經過表面修飾的量子點可以通過多種化學方法與核酸探針進行偶聯(lián)。我們采用了戊二醛交聯(lián)法,其步驟如下:


  1. 將表面修飾的量子點溶液與核酸探針溶液混合,加入適量的戊二醛溶液。

  2. 在一定的溫度和 pH 條件下反應數小時,使量子點表面的活性基團與核酸探針上的氨基通過戊二醛形成共價鍵。

  3. 通過凝膠過濾色譜或離心等方法去除未偶聯(lián)的量子點和戊二醛,得到量子點標記的核酸探針。

五、原位雜交實驗

(一)樣本制備


  1. 細胞樣本
    對于細胞樣本,我們采用常規(guī)的細胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)目標細胞,如 HeLa 細胞。在細胞生長至適當密度后,進行固定處理。常用的固定劑包括多聚甲醛、甲醇 - 醋酸等。我們選擇 4% 多聚甲醛固定細胞 15 - 20 分鐘,然后用 PBS 緩沖液洗滌多次,以去除多余的固定劑。

  2. 組織樣本
    組織樣本取自實驗動物,如小鼠。將組織塊迅速冷凍后,進行切片處理,切片厚度一般為 5 - 10μm。切片在空氣中干燥后,同樣用 4% 多聚甲醛固定,后續(xù)用 PBS 洗滌。

(二)雜交前處理


  1. 通透處理
    為了使探針能夠進入細胞或組織內部與目標核酸序列雜交,需要對樣本進行通透處理。對于細胞樣本,我們使用 0.5% Triton X - 100 溶液處理 10 - 15 分鐘。對于組織切片,可以適當延長通透時間至 20 - 30 分鐘。

  2. 預雜交
    在雜交之前,進行預雜交處理以減少非特異性雜交。將樣本浸泡在含有非特異性核酸(如鮭魚精 DNA)和封閉劑(如牛血清白蛋白)的雜交緩沖液中,在一定溫度下孵育 30 - 60 分鐘。

(三)雜交反應


將制備好的量子點標記核酸探針加入到雜交緩沖液中,然后將雜交緩沖液滴加到樣本上,覆蓋上蓋玻片。在適宜的溫度下(根據探針和目標序列的性質確定,一般在 37 - 65°C 之間)進行雜交反應,反應時間根據探針濃度和目標核酸的豐度而定,一般為 2 - 16 小時。

(四)雜交后洗滌


雜交后,需要進行嚴格的洗滌以去除未雜交的探針。采用逐步降低鹽濃度的洗滌緩沖液進行洗滌,如先用高鹽緩沖液(如 2×SSC)洗滌,然后逐漸降低到低鹽緩沖液(如 0.1×SSC),同時可以適當提高洗滌溫度,以提高洗滌效果。

(五)檢測與分析


  1. 熒光顯微鏡觀察
    由于量子點具有熒光特性,雜交后的樣本可以直接在熒光顯微鏡下觀察。通過選擇合適的濾光片,可以激發(fā)量子點并檢測其發(fā)射的熒光,從而觀察到目標核酸在細胞或組織中的分布情況。同時,可以使用圖像分析軟件對熒光信號進行定量分析,以評估目標核酸的表達水平。

  2. 共聚焦顯微鏡分析
    對于需要更高分辨率的觀察,可以使用共聚焦顯微鏡。共聚焦顯微鏡可以對樣本進行斷層掃描,獲得更清晰的三維圖像,有助于準確分析目標核酸在細胞內的定位。

六、實驗結果與討論

(一)量子點標記效率


通過紫外 - 可見吸收光譜和熒光光譜分析,我們發(fā)現量子點與核酸探針的偶聯(lián)效率較高,大部分量子點成功標記上了核酸探針。這主要得益于表面修飾和偶聯(lián)方法的優(yōu)化,使得量子點與核酸之間形成了穩(wěn)定的共價鍵。

(二)雜交特異性


在原位雜交實驗中,我們設置了陽性對照組(含有目標核酸序列的樣本)和陰性對照組(不含有目標核酸序列的樣本)。結果顯示,陽性對照組在預期位置出現明顯的熒光信號,而陰性對照組幾乎沒有熒光信號,表明我們制備的量子點標記核酸探針具有較高的雜交特異性。這歸因于探針設計的合理性和嚴格的雜交條件控制。

(三)靈敏度分析


通過對不同濃度的目標核酸樣本進行雜交實驗,我們發(fā)現量子點標記核酸探針的檢測靈敏度明顯高于傳統(tǒng)的熒光標記探針。即使在目標核酸濃度較低的情況下,仍然能夠檢測到清晰的熒光信號,這主要是由于量子點的高量子產率和光穩(wěn)定性,使得微弱的雜交信號也能夠被有效檢測。

(四)穩(wěn)定性研究


對標記后的探針進行長期保存實驗,發(fā)現在合適的緩沖液和保存條件下,量子點標記核酸探針在數周內仍保持較好的穩(wěn)定性,熒光性能沒有明顯下降。這為其實際應用提供了便利,減少了探針頻繁制備的麻煩。

七、結論


本文成功開發(fā)了一種新型的量子點標記核酸探針制備方法,并將其應用于原位雜交技術。通過對量子點的選擇、表面修飾、核酸探針設計和偶聯(lián)方法的優(yōu)化,以及對原位雜交實驗條件的精細調控,獲得了具有高靈敏度、高特異性和良好穩(wěn)定性的量子點標記核酸探針。這些探針在細胞和組織樣本的核酸檢測中表現出優(yōu)異的性能,為生物醫(yī)學研究中的基因表達分析、病原體檢測等領域提供了一種強大的新工具。未來的研究可以進一步探索量子點標記核酸探針在多色成像和活體檢測等更復雜應用場景中的潛力,推動生物醫(yī)學診斷和研究向更高水平發(fā)展。


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