摘要：本研究旨在建立一種高效電穿孔介導siRNA轉染原代軟骨細胞的方法，以實現(xiàn)基因沉默效果并維持較高的細胞存活率。通過優(yōu)化電穿孔參數(shù)和使用高效電轉緩沖液，成功實現(xiàn)了siRNA的高效轉染，為基因功能研究和疾病機制探討提供了有力工具。

引言

在生命科學研究領域，RNA干擾（RNAi）技術已成為研究基因功能和疾病機制的重要工具。小干擾RNA（siRNA）作為RNAi的關鍵效應分子，能夠特異性地沉默目標基因的表達。然而，由于細胞類型的多樣性和siRNA的自身特性，siRNA的轉染過程面臨諸多挑戰(zhàn)。原代軟骨細胞作為一類難以轉染的細胞類型，其基因功能的研究尤為困難。因此，建立一種高效、穩(wěn)定的siRNA轉染原代軟骨細胞的方法具有重要的科學意義和實際應用價值。

電穿孔法是一種利用短暫的高壓電脈沖在細胞膜上形成瞬時小孔，使外源分子能夠進入細胞內的技術。該方法具有轉染效率高、適用范圍廣等優(yōu)點，尤其適用于一些難以轉染的細胞類型。本研究旨在通過優(yōu)化電穿孔參數(shù)和使用高效電轉緩沖液，建立一種高效電穿孔介導siRNA轉染原代軟骨細胞的方法，以實現(xiàn)基因沉默效果并維持較高的細胞存活率。

材料與方法

1. 實驗材料

• 細胞：出生后5天的FVB品系小鼠，用于分離原代軟骨細胞。

• 試劑：某試劑Ⅰ型膠原酶、某試劑Ⅱ型膠原酶、某試劑鏈絲菌蛋白酶、某品牌高效電轉緩沖液、某品牌臺盼藍染色劑、某品牌pCMV-EGFP表達質粒、某品牌siRNA（對照siRNA和Sox9 siRNA）。

• 儀器：威尼德電穿孔儀、某品牌熒光顯微鏡、某品牌實時熒光定量PCR儀、某品牌Western blot分析系統(tǒng)。

2. 實驗方法

• 原代軟骨細胞的分離：取出生后5天的FVB品系小鼠2只，分離四肢關節(jié)及肋軟骨，加入含0.1%Ⅰ型膠原酶的DMEM培養(yǎng)基，置于細胞培養(yǎng)箱中37℃消化1小時。然后在解剖鏡下刷去軟骨外的軟組織，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2遍后，再用0.2%Ⅱ型膠原酶37℃消化過夜。第2天，加入1mg/ml鏈絲菌蛋白酶繼續(xù)消化3小時，期間每隔1小時吹打1次。

• 電穿孔轉染質粒：將獲取的單個軟骨細胞在室溫下用PBS洗兩遍，計數(shù)。用電轉緩沖液重懸細胞（5×10^5個細胞/100微升），每100微升電轉緩沖液中加入5微克pCMV-EGFP-C1質粒，混勻后加入電轉杯（2毫米間隙）中。電穿孔儀采用170V/15ms的參數(shù)進行電轉。電穿孔后立刻加入1毫升已預溫的高糖DMEM培養(yǎng)基，并轉移至24孔培養(yǎng)皿中，取少許細胞進行臺盼藍染色計數(shù)細胞活率，其余的細胞繼續(xù)培養(yǎng)48小時。

• 轉染效率確定：電穿孔后48小時，在熒光顯微鏡下隨機取10個視野，計數(shù)表達綠色熒光蛋白（發(fā)綠光）的細胞數(shù)，同時在可見光下計數(shù)細胞總數(shù)。計算轉染率（%）=（發(fā)出綠色熒光的細胞數(shù)/總細胞數(shù)）×100%。

• siRNA轉染及基因沉默效果的評估：將處理得到的原代軟骨細胞，用電轉緩沖液重懸細胞（5×10^5個細胞/100微升），在每100微升電轉緩沖液中加入5微升10微摩爾/升的對照siRNA或Sox9 siRNA，混勻后加入電轉杯（2毫米間隙）中，選擇170V/15ms進行電轉，電轉后加入培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時。收獲細胞用常規(guī)方法提取總RNA和總蛋白，進行real-time PCR以及Western blot法檢測分析Sox9的mRNA和蛋白表達量。

• real-time PCR分析：將總RNA用DNAase處理后反轉錄成cDNA，然后采用SYBR Green反應體系進行real-time PCR分析。

• Western blot法分析：將得到的總蛋白定量后進行裂解變性，經(jīng)10%SDS-PAGE電泳分離后，轉至硝酸纖維素膜上，以含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1小時后沿60kDa marker處裁開，分別加入一抗Sox9抗體與β-actin抗體，4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次5分鐘，分別加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1小時，TBST洗膜3次后，化學曝光顯影。并用隨機附帶軟件對目的條帶進行灰度值掃描，計算出Sox9與內參β-actin的灰度值比值，進行蛋白的半定量分析。

實驗結果

1. 細胞存活率：電穿孔后原代軟骨細胞的存活率大于80%，表明優(yōu)化后的電穿孔參數(shù)對細胞損傷較小，能夠維持較高的細胞存活率。

2. 質粒轉染效率：質粒的轉染效率達到37.3%±5.2%，說明高效電轉緩沖液和優(yōu)化的電穿孔參數(shù)能夠提高質粒的轉染效率。

3. siRNA靶分子的mRNA和蛋白表達水平：轉染Sox9 siRNA后，原代軟骨細胞中的Sox9 mRNA和蛋白表達水平分別下調了75%和66%，達到了理想的基因沉默效果。

討論

1. 電穿孔參數(shù)的選擇：電穿孔參數(shù)的選擇是影響轉染效率的關鍵因素。本研究通過優(yōu)化電穿孔參數(shù)，如電壓、脈沖時間和脈沖次數(shù)等，成功實現(xiàn)了siRNA的高效轉染。同時，細胞類型、細胞密度、siRNA的濃度等也會對轉染效果產(chǎn)生影響，需要在實驗過程中進行優(yōu)化。

2. 鏈絲菌蛋白酶的作用：原代軟骨細胞能分泌多種細胞外基質，這些細胞外基質在軟骨細胞周圍形成較致密的結構，影響電穿孔的效率。本研究使用鏈絲菌蛋白酶對軟骨細胞進行進一步消化，并通過間斷吹打促使其細胞外基質的酶解，從而提高了電穿孔的效率。

3. 高效電轉緩沖液的應用：高效電轉緩沖液能夠提高一些普遍認為難以電轉的細胞的存活率與轉染效率。本研究選用的高效電轉緩沖液適用于原代軟骨細胞，能夠在保證較高細胞存活率的同時達到滿意的RNAi效果。

4. siRNA的選擇與設計：siRNA的序列設計是實驗成功的基礎。本研究選擇了針對Sox9基因的siRNA，并保證了其二級結構和熱力學穩(wěn)定性，從而提高了基因沉默效率。同時，siRNA的濃度和轉染時間也會影響轉染效果，需要在實驗過程中進行優(yōu)化。

策略與創(chuàng)新

1. 策略：本研究通過優(yōu)化電穿孔參數(shù)、使用高效電轉緩沖液和鏈絲菌蛋白酶消化等方法，成功建立了高效電穿孔介導siRNA轉染原代軟骨細胞的方法。該方法具有轉染效率高、細胞存活率高等優(yōu)點，為基因功能研究和疾病機制探討提供了有力工具。

2. 創(chuàng)新：本研究將電穿孔法應用于原代軟骨細胞的siRNA轉染，并成功實現(xiàn)了高效轉染和基因沉默。同時，通過優(yōu)化實驗條件和方法，提高了轉染效率和細胞存活率，為其他難以轉染的細胞類型提供了借鑒和參考。

應用前景

本研究建立的高效電穿孔介導siRNA轉染原代軟骨細胞的方法具有廣泛的應用前景。首先，該方法可以用于研究軟骨細胞相關基因的功能和調控機制，為軟骨疾病的治療提供理論基礎。其次，該方法還可以用于篩選和鑒定針對軟骨疾病的潛在藥物靶點，為藥物研發(fā)提供有力支持。此外，該方法還可以擴展到其他難以轉染的細胞類型，為生命科學研究和疾病機制探討提供新的思路和方法。

結論

本研究成功建立了高效電穿孔介導siRNA轉染原代軟骨細胞的方法，實現(xiàn)了基因沉默效果并維持了較高的細胞存活率。通過優(yōu)化電穿孔參數(shù)、使用高效電轉緩沖液和鏈絲菌蛋白酶消化等方法，提高了轉染效率和細胞存活率。該方法具有廣泛的應用前景，可以用于研究軟骨細胞相關基因的功能和調控機制，為軟骨疾病的治療和藥物研發(fā)提供有力支持。同時，該方法還可以擴展到其他難以轉染的細胞類型，為生命科學研究和疾病機制探討提供新的思路和方法。