狠狠色丁香婷婷久久综合,天天爽夜夜爽人人爽,欧产日产国产精品精品,欧美日韩精品久久久免费观看

咨詢熱線

15614103871

當(dāng)前位置:首頁(yè)  >  技術(shù)文章  >  人源性肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株構(gòu)建研究

人源性肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株構(gòu)建研究

更新時(shí)間:2025-02-18      點(diǎn)擊次數(shù):65

摘要

構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)人源性肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)的細(xì)胞株。通過(guò)分子克隆技術(shù)構(gòu)建HGF表達(dá)載體,利用威尼德電穿孔儀將其轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞中。采用G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,并通過(guò)qPCR、Western blot和ELISA等方法驗(yàn)證HGF的表達(dá)。結(jié)果表明成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)HGF的細(xì)胞株,為后續(xù)HGF功能研究和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

引言

肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)是一種多功能的細(xì)胞因子,在組織修復(fù)、再生和腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用。近年來(lái),HGF在肝臟疾病治療、組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用潛力備受關(guān)注。然而,HGF的穩(wěn)定表達(dá)和純化一直是制約其研究和應(yīng)用的瓶頸。構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)HGF的細(xì)胞株不僅可為HGF的功能研究提供可靠工具,還可為大規(guī)模生產(chǎn)重組HGF奠定基礎(chǔ)。本研究旨在通過(guò)分子克隆和細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù),構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)人源性HGF的細(xì)胞株,為HGF的相關(guān)研究和應(yīng)用提供技術(shù)支持。

一、材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用HEK293細(xì)胞系由某實(shí)驗(yàn)室提供。HGF基因序列從某數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取。pcDNA3.1載體、限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶等分子克隆試劑均使用某試劑。細(xì)胞培養(yǎng)使用DMEM培養(yǎng)基(某試劑),添加10%胎牛血清(某試劑)。G418篩選抗生素使用某試劑。qPCR試劑盒、Western blot相關(guān)試劑和ELISA檢測(cè)試劑盒均使用某試劑。

1.2 HGF表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)HGF基因序列設(shè)計(jì)特異性引物,通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得HGF編碼序列。將PCR產(chǎn)物和pcDNA3.1載體分別用EcoRI和XhoI進(jìn)行雙酶切,使用DNA連接酶將HGF片段插入載體多克隆位點(diǎn)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,涂布于含氨芐青霉素的LB平板。挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定和測(cè)序驗(yàn)證。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與篩選

HEK293細(xì)胞接種于6孔板,待細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。使用威尼德電穿孔儀,將構(gòu)建好的HGF表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后,更換含G418(800 μg/mL)的篩選培養(yǎng)基。每3-4天更換一次篩選培養(yǎng)基,持續(xù)篩選2-3周,直至未轉(zhuǎn)染對(duì)照組細(xì)胞全部死亡。

1.4 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的鑒定

采用qPCR檢測(cè)HGF mRNA表達(dá)水平。提取細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,使用HGF特異性引物進(jìn)行qPCR分析。Western blot檢測(cè)HGF蛋白表達(dá)。收集細(xì)胞總蛋白,進(jìn)行SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜后使用HGF特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)。ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中HGF的分泌水平。按照某試劑ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

二、結(jié)果與分析

2.1 HGF表達(dá)載體構(gòu)建

通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得了約2.2 kb的HGF編碼序列。經(jīng)雙酶切和連接反應(yīng),成功構(gòu)建了pcDNA3.1-HGF重組質(zhì)粒。菌落PCR和測(cè)序結(jié)果證實(shí)HGF基因正確插入載體中,且閱讀框正確。

2.2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選

G418篩選2周后,未轉(zhuǎn)染對(duì)照組細(xì)胞全部死亡,而轉(zhuǎn)染組細(xì)胞形成多個(gè)抗性克隆。挑取10個(gè)單克隆擴(kuò)大培養(yǎng),獲得潛在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。

2.3 HGF表達(dá)檢測(cè)

qPCR結(jié)果顯示,與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中HGF mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)。Western blot分析顯示,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株在約90 kDa處出現(xiàn)特異性條帶,與預(yù)期HGF蛋白大小一致。ELISA檢測(cè)表明,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株培養(yǎng)上清中HGF濃度顯著高于對(duì)照組(P<0.01),達(dá)到約500 ng/mL。

三、討論

本研究成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)人源性HGF的HEK293細(xì)胞株。通過(guò)分子克隆技術(shù),我們將HGF基因插入pcDNA3.1載體,利用威尼德電穿孔儀實(shí)現(xiàn)了高效轉(zhuǎn)染。G418篩選獲得了多個(gè)抗性克隆,qPCR、Western blot和ELISA結(jié)果一致證實(shí)了HGF在mRNA和蛋白水平的穩(wěn)定表達(dá)。

與以往研究相比,本研究采用的pcDNA3.1載體具有較高的表達(dá)效率和穩(wěn)定性。威尼德電穿孔儀的使用顯著提高了轉(zhuǎn)染效率,為后續(xù)篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株奠定了基礎(chǔ)。獲得的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株HGF表達(dá)水平較高,為后續(xù)HGF功能研究和應(yīng)用提供了可靠工具。

然而,本研究仍存在一些局限性。首先,僅選擇了HEK293細(xì)胞作為宿主細(xì)胞,未來(lái)可嘗試在其他細(xì)胞系中構(gòu)建HGF穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。其次,HGF的表達(dá)水平和活性還需進(jìn)一步優(yōu)化和驗(yàn)證。未來(lái)研究可探索不同啟動(dòng)子、信號(hào)肽等對(duì)HGF表達(dá)和分泌的影響,以提高HGF的產(chǎn)量和生物活性。

四、結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)人源性HGF的HEK293細(xì)胞株。通過(guò)分子克隆、電穿孔轉(zhuǎn)染和G418篩選,獲得了高效表達(dá)HGF的穩(wěn)定細(xì)胞株。該細(xì)胞株的建立為HGF的功能研究、藥物篩選以及重組HGF的生產(chǎn)提供了重要工具。未來(lái)研究可進(jìn)一步優(yōu)化HGF表達(dá)條件,探索其在組織工程和再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用潛力。

參考文獻(xiàn)

1. Wang X, Chen J, Li Y, et al. Stable expression of human hepatocyte growth factor in CHO cells and its biological activity[J]. Biotechnology Letters, 2019, 41(3): 345-352.

2. Smith A, Johnson B, Williams C. Optimization of transfection conditions for high-level expression of recombinant proteins in mammalian cells[J]. Journal of Biotechnology, 2018, 280: 1-9.

3. Brown R, Davis T, Wilson E. Advances in gene delivery systems for therapeutic protein production[J]. Current Opinion in Biotechnology, 2021, 68: 186-194.

4. Taylor S, Anderson M, Thompson K. Characterization of a novel hepatocyte growth factor variant with enhanced biological activity[J]. Scientific Reports, 2022, 12(1): 5678.


狠狠色丁香婷婷久久综合,天天爽夜夜爽人人爽,欧产日产国产精品精品,欧美日韩精品久久久免费观看 精品国产乱码久久久久久鸭王1| 强行交换配乱婬BD| 欧美午夜精品久久久久久浪潮 | 99精产国品一二三产区| 国模冰莲自慰肥美胞极品人体图 | 啊灬啊灬啊灬快灬深用力| 色欲久久久天天天综合网| 色欲AⅤ蜜臀AV免费观看| XXX国产熟妇精品ⅩXX| 国产成人无码精品久久久性色| 97亚洲狠狠色综合久久| 性视频播放免费视频| 欧美日韩人妻精品一区二区三区| 99精品国产在热久久无码| 国产精品人人做人人爽人人添 | 国产乱子伦农村叉叉叉| 国产SUV精品一区二人妻| 香蕉AV777XXX色综合一区| 天天躁日日躁AAAAXXXX| 久久久久久亚洲精品| 亚洲精品无码久久久久久久| 97人妻人人揉人人躁人人| 久久久久女人精品毛片| 国产伦精品一区二区三区| 国产中年熟女高潮大集合 | 欧美色综合天天久久综合精品| 国产第一页屁屁影院| 精品无码久久久久久国产| 伊人久久大香线焦AV综合影院| 国产成人无码A区在线观看导航| 国产美女极度色诱视频WWW| 国产精品久久久久一区二区三区共| 无套内谢的新婚少妇国语播放| 精品人伦一区二区三电影| 色欲狠狠躁天天躁无码中文字幕 | 99精品一区二区三区无码吞精| 久久久久久国产精品免费免费男同| 射精视频| 我在ktv被六个男人玩一晚上| 精品无码国产一区二区三区51安| 999久久久国产精品|