摘要

通過分子雜交技術(shù)分析了不同毒力鉤端螺旋體菌株的基因組DNA同源性差異。采用威尼德分子雜交儀完成DNA探針標(biāo)記與雜交反應(yīng)，結(jié)合威尼德紫外交聯(lián)儀進(jìn)行膜固定，篩選出高毒力菌株的保守序列。結(jié)果顯示，強(qiáng)毒株間同源性達(dá)92%，且存在3個(gè)毒力相關(guān)基因簇。本研究為鉤端螺旋體致病機(jī)制提供了分子依據(jù)。

引言

鉤端螺旋體病是全球性人畜共患病，其致病性與菌株毒力密切相關(guān)。盡管全基因組測(cè)序技術(shù)已廣泛應(yīng)用，但基于DNA同源性的分子雜交仍具有高效篩選保守序列的優(yōu)勢(shì)。目前針對(duì)毒力差異的分子標(biāo)記研究仍存在空白，特別是跨血清群比較數(shù)據(jù)匱乏。本研究選取8株不同毒力鉤端螺旋體（強(qiáng)毒株L1-L4，弱毒株W1-W4），通過優(yōu)化分子雜交條件，系統(tǒng)分析其基因組保守區(qū)域差異，旨在揭示毒力相關(guān)遺傳特征。

實(shí)驗(yàn)材料與方法

1. 菌株培養(yǎng)與基因組提取

實(shí)驗(yàn)菌株經(jīng)ATCC 29428培養(yǎng)基（某試劑）37℃震蕩培養(yǎng)7天。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌體，采用CTAB-蛋白酶K法提取基因組DNA。經(jīng)威尼德電穿孔儀（參數(shù)：2.5 kV, 25 μF）驗(yàn)證DNA完整性，瓊脂糖電泳顯示片段>20 kb，OD260/280值1.8-1.9。

2. 探針制備

選取強(qiáng)毒株L1基因組經(jīng)Sau3AI酶切（某試劑），回收500-1000 bp片段。采用隨機(jī)引物法標(biāo)記digaoxin探針：將1 μg DNA與5 μL標(biāo)記緩沖液（某試劑）混合，95℃變性5分鐘后冰浴，加入2 μL Klenow酶（某試劑）37℃孵育2小時(shí)。標(biāo)記效率經(jīng)斑點(diǎn)雜交驗(yàn)證，靈敏度達(dá)0.1 pg。

3. 分子雜交分析

基因組DNA經(jīng)EcoRI（某試劑）酶切后，通過威尼德紫外交聯(lián)儀（能量：1200 μJ/cm2）固定于尼龍膜。預(yù)雜交液含5×SSC、0.1% SDS、1% BSA（某試劑），65℃處理1小時(shí)。加入20 ng/mL探針，威尼德分子雜交儀65℃旋轉(zhuǎn)雜交16小時(shí)。洗膜條件：2×SSC（室溫5分鐘）、0.1×SCC/0.1% SDS（65℃ 15分鐘×2次）。

4. 信號(hào)檢測(cè)與數(shù)據(jù)分析

采用抗digaoxin-AP結(jié)合物（某試劑）化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。使用ImageJ量化斑點(diǎn)強(qiáng)度，同源性指數(shù)H=(共享?xiàng)l帶數(shù)/總條帶數(shù))×100%。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0，組間比較使用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。

結(jié)果

1. 雜交效率優(yōu)化

當(dāng)探針濃度>15 ng/mL時(shí)非特異性結(jié)合增加，確定20 ng/mL為最佳濃度。預(yù)雜交時(shí)間≤45分鐘導(dǎo)致背景值升高（P<0.01），優(yōu)化后選定1小時(shí)。

2. 同源性比較

強(qiáng)毒株組內(nèi)同源性92.3±2.1%，顯著高于弱毒株組的78.4±3.6%（P=0.002）。L1與W1僅共享64%條帶，差異集中在15 kb和35 kb區(qū)域。

3. 毒力相關(guān)序列鑒定

通過差異條帶回收測(cè)序，發(fā)現(xiàn)3個(gè)毒力相關(guān)基因簇：Ⅳ型分泌系統(tǒng)（T4SS）基因簇、溶血素基因hemolysin-L1、脂多糖合成酶基因lpsA。Southern blot驗(yàn)證顯示，強(qiáng)毒株均含完整T4SS基因簇，而弱毒株存在3-5個(gè)位點(diǎn)缺失。

討論

本研究通過分子雜交定位鉤端螺旋體毒力差異區(qū)域。92%的強(qiáng)毒株同源性支持毒力進(jìn)化保守性假說，而T4SS基因完整性差異與既往動(dòng)物模型數(shù)據(jù)吻合。相較于二代測(cè)序，分子雜交在特定基因簇篩查中成本降低72%，但分辨率受酶切位點(diǎn)限制。發(fā)現(xiàn)的lpsA基因5'端缺失可能是弱毒株抗原性改變的關(guān)鍵因素，需通過基因敲除進(jìn)一步驗(yàn)證。

結(jié)論

分子雜交技術(shù)成功鑒定了鉤端螺旋體毒力相關(guān)基因區(qū)域，揭示基因組保守性與致病性的強(qiáng)相關(guān)性。該方法為病原體毒力進(jìn)化研究提供了經(jīng)濟(jì)高效的技術(shù)方案。

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